Человеческий организм изобилует триллионами микробных клеток, составляющих микробиом, многие из которых являются бактериями. Несмотря на то, что они могут быть небольшими, некоторые из этих бактерий поддерживают здоровье, в то время как другие способствуют заболеванию. Эти различия часто сводятся к генам в геноме каждой бактерии, но поиск и секвенирование редких штаммов может оказаться сложной задачей.
Команда под руководством д-ра Gang Fang разработала метод секвенирования mEnrich-seq, который обогащает образцы интересующими бактериями.
Брайан Шатц Ган Фанг, генетик из медицинской школы Икана на горе Синай, предложил новое решение под названием mEnrich-seq, основанное на его десятилетних эпигеномных исследованиях бактерий, позволяющее различать ДНК разных видов для метагеномных исследований.1 В интервью The Scientist Фанг описывает свое видение того, как mEnrich-seq может помочь ученым ответить на сложные вопросы о бактериях-спутниках человека.
Каковы основные проблемы, связанные с изучением микробиома человека с помощью метагеномики?
У нас есть множество технологий, позволяющих по-разному понять микробиом, но есть одна общая проблема. Если в образце много бактерий, то мы можем узнать о нем практически все, что угодно, но если численность вида действительно низкая, его очень трудно изучать. Могут существовать даже два или три сосуществующих штамма одного и того же вида, и важным штаммом может быть не тот, который относительно более распространен. Эти разные штаммы часто очень похожи по своим геномам, поэтому провести различие между ними чрезвычайно сложно.
Что побудило вас к разработке enrich-seq?
Если цель исследования достаточно редкий вид микробов, то большая часть ресурсов для секвенирования будет потрачена на более распространенные виды. Поэтому нам нужна была новая стратегия перед секвенированием. Естественные эпигенетические штрих-коды бактерий дают нам уникальный способ решить эту проблему. Несмотря на то, что разные виды и штаммы имеют схожие геномы, они часто кодируют разные ДНК-метилтрансферазы, которые определяют характер метилирования ДНК.
Бактерии делают это, чтобы отличить свою ДНК от чужеродной. Мы можем использовать это для дифференциации геномов видов или штаммов на основе глобального паттерна метилирования. Если мы хотим воздействовать на определенный геном и знаем его паттерн метилирования, мы можем рационально выбрать рестрикционные ферменты, которые будут сокращать определенную последовательность, называемую мотивом метилирования. Ферменты расщепят подавляющее большинство исходной ДНК, которая не имеет соответствующего метилирования. С помощью mEnrich-seq мы можем обогатить интересующие бактерии более чем в 100 раз.
Как этот протокол соотносится со стандартным экспериментом по метагеномному секвенированию?
Мы действительно учитывали это при разработке. Мы хотели, чтобы это было эффективно, но в то же время было очень просто подключить к существующему конвейеру. В конечном счете, enrich-seq включает в себя всего два этапа в дополнение к стандартной подготовке библиотеки. На первом этапе, после лигирования адаптера и перед амплификацией, мы расщепляем ДНК с помощью рационально подобранного рестрикционного фермента. При расщеплении ДНК с уже лигированным адаптером только интактная ДНК будет иметь лигированные адаптеры на обоих концах и может быть амплифицирована по всей длине. Другая ДНК будет намного короче, что приводит ко второму этапу: после амплификации мы проводим отбор по размеру. Остальные этапы, такие как контроль качества, остаются прежними.
В каких случаях, по вашему мнению, этот метод мог бы быть наиболее полезен?
Одно из применений - борьба с устойчивостью к антибиотикам, например, при инфекциях мочевыводящих путей (ИМП). В идеале клиницисты хотят точно определить гены устойчивости к антибиотикам, которые несет штамм ИМП у пациента, но в образце мочи содержится много ДНК хозяина и других бактерий. В настоящее время наилучшей практикой при ИМП является посев мочи, который занимает три дня, чтобы получить результат. Это не идеально. Мы хотим быстро — в течение одного дня — составить профиль устойчивости к антибиотикам, чтобы врач мог решить, какие антибиотики назначить пациенту.
Другое применение - полезные бактерии, или пробиотики, такие как бифидобактерии. Разные штаммы могут по-разному влиять на здоровье. Если мы хотим обнаружить пробиотики, связанные с болезнями человека или реакцией на лекарственные препараты, нам необходимо провести первоначальный скрининг, чтобы сузить круг видов в образцах кала и выявить более перспективных кандидатов. Многие люди интересуются этими приложениями, и мы считаем, что mEnrich-seq предлагает новый, более чувствительный, надежный и экономичный способ решения этих проблем.